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生物素-LC-酰肼(Biotin-LC-Hydrazides)可用于碳水化合物基团被氧化形成醛的生物素化大分子。酰肼基团与羰基(醛和酮)反应，生成腙键。唾液酸是蛋白质多糖的常见糖组分，该组分易被1mM高碘酸钠(NaIO4)氧化，其他糖基团可以用5～10mM高碘酸钠有效氧化。对于糖蛋白，糖组分的氧化会产生醛基，使其成为被标记部分而不影响对蛋白质功能非常重要的多肽结构域。例如，大多数多克隆抗体在抗原结合位点之外的区域被糖基化，使得它们能够用生物素-酰肼试剂进行标记，而不会在其免疫测定中对其功能产生不利影响。请注意，单克隆抗体可能缺乏糖基化的基团。

生物素-LC-酰肼含有简单的长链烃，其间隔臂可以减少生物素结合测定中的空间位阻。生物素LC-酰肼试剂也可以在碳二亚胺EDC存在下与羧基与反应。EDC能够激活羧基，使其与生物素化试剂的-NH2基团结合，形成酰胺键。如果该分子在其表面上同时具有羧基和伯胺，则使用EDC可能导致一些肽或蛋白质发生聚合。降低EDC的量或增加反应中生物素试剂的量可使聚合最小化。

分子量	371.5
间隔臂长	24.7 Å
纯度	>95% on TLC
净增加质量	353.19
结构式

• 在氧化和生物素化步骤中要避免使用Tris和其他含伯胺的缓冲液，因为这些缓冲液会与醛和酰肼反应。
  
• 所有三种生物素酰肼试剂都可以溶于50mM二甲基亚砜(DMSO)中，然后稀释成水相混合物。(不要使用二甲基甲酰胺，DMF等，其它试剂的溶解度较差。)生物素酰肼和生物素-LC-酰肼可直接在水相缓冲液中溶解至约5mM;生物素-PEG4-酰肼可溶于水相缓冲液中至浓度约20mM。
  
• 在无胺和中性条件(pH6.5～7.5)下，酰肼与羰基的反应最有效。羰基可能存在于多糖的还原末端，为了产生其他羰基，可以使用特异性氧化酶(例如半乳糖氧化酶)或1～10mM高碘酸钠(NaIO4)来氧化糖基团。尽管可以使用中性缓冲液如磷酸盐缓冲液，但在酸性条件(如0.1M乙酸钠，pH5.5)中，高碘酸盐的氧化是最有效的。如果在酸性条件下进行氧化，则可能需要通过透析或凝胶过滤进行缓冲液交换，换成中性缓冲液来获得最佳的酰肼反应。
  
• EDC为媒介的反应通常在pH4.5～5的MES缓冲液中进行。避免使用含有伯胺(Tris，甘氨酸等)或羧基(乙酸盐，柠檬酸盐等)的缓冲液，因为它们会猝灭反应。磷酸盐缓冲液不是最佳选择，因为它会降低共轭效率，尽管通过加入更多的EDC克服这种影响。

• 所需材料
  生物素-LC-酰肼溶液：50mM生物素酰肼试剂溶于二甲基亚砜(DMSO)中。制备步骤B.4中足以达到最终浓度的体积。过量(未使用)溶解的试剂可能稳定，但尚未证实。
  
  • 氧化缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5。
    
  • 高碘酸钠溶液：20mM高碘酸钠溶于氧化缓冲液中。在实验前立即溶解，使用琥珀色小瓶或其他避光容器。
    
  • 偶联缓冲液：0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.2(PBS)或其它中性或微碱性非胺缓冲液。
    
  • 糖蛋白溶液：2mg/mL糖蛋白溶于氧化缓冲液中。
    
  • 透析盒或脱盐柱。
• 操作步骤
  
  • 将1mL预冷的高碘酸钠溶液加入1mL预冷的糖蛋白溶液中混匀，然后避光反应，在冰上或4℃下孵育30分钟。
    
    • 如果仅氧化唾液酸基团，代替1mL只加入50μL高碘酸钠(使高碘酸钠的终浓度是1mM而不是10mM)。
  • 除去过量的高碘酸钠，在偶联缓冲液中透析更换样品缓冲液，或用偶联缓冲液平衡的脱盐柱进行凝胶过滤.
    
  • 将1份制备的50mM生物素酰肼溶液加入到9份2步骤里被氧化过的样品中(5mM生物素酰肼)，室温下孵育2小时。
    
    • 最佳的生物素-酰肼浓度和反应条件取决于靶蛋白和下游应用，必须用实验确定。
  • 通过透析或凝胶过滤(脱盐柱)将生物素化的分子与未反应的物质分离，可以用与非生物素化样品相同的条件来储存生物素化的样品。

• 所需材料
  
  • 生物素酰肼溶液：50mM生物素酰肼试剂溶于二甲基亚砜MES缓冲液：0.1M。
    
  • MES，pH4.7～5.5。
    
  • EDC溶液：100mg/mL EDC溶于MES缓冲液中(约0.5M EDC溶液)。EDC在步骤B3中使用前准备。
    
  • 透析盒或脱盐柱。
• 操作步骤
  
  • 在5～10mg/mL的MES缓冲液中溶解蛋白质(含羧基)。
    
  • 每1mL蛋白质溶液加入25μL生物素酰肼溶液混合(1.25mM试剂)。
    
  • 每1mL蛋白质溶液加入12.5μL EDC溶液并混合(约6.5mM EDC)。
    
  • 搅拌并在室温下孵育2小时至过夜。
    
  • 离心去除反应过程中形成的沉淀物。透析或凝胶过滤(脱盐柱)将生物素化分子与未反应的物质分离。
    
  • 注意：生物素化样品可以使用与非生物素化样品相同的条件进行储存。典型的储存条件为4℃，可以保存数周。